Научное общество «Клиническая гемостазиология». Публикации

Способ получения тромбоцитов

В.А.Лифановский.
Изобретение. Патент РФ 2068265

Введение

Способ получения тромбоцитов относится к гематологии. Цель изобретения - экономия крови и повышение степени очистки тромбоцитов. Тромбоциты культивируются в синтетической питательной среде. Способ включает операции: выделение тромбоцитов из крови дифференциальным центрифугированием, приготовление жидкой и твердой питательной сред, посев тромбоцитов в жидкую питательную среду, посев на твердую питательную среду, посев на жидкую питательную среду, выделение тромбоцитов из среды и их промывка солевыми растворами. Культивирование производится при температуре 0 - 44°С в течение 1 - 45 суток при аэрации. Полученные тромбоциты и среда после культивирования в ней тромбоцитов могут быть использованы как сырье при производстве лекарственных препаратов.
Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии и вопросу получения клеток крови и их заменителей.
Известен способ получения тромбоцитов, включающий последовательное центрифугирование индивидуальных доз крови с последующей отмывкой. При первом мягком центрифугировании крови осаждаются эритроциты и лейкоциты. При втором, более жестком центрифугировании осаждаются тромбоциты. Полученные тромбоциты отмываются различными солевыми средами (О.К.Гаврилов, Г.И.Козинец, Н.Б.Черняк "Клетки костного мозга и периферической крови" //М., "Медицина",1985 г., с.227 - 231).
Недостатком указанного способа получения тромбоцитов является то, что для его осуществления, для получения нужного количества тромбоцитов, требуется большое количество крови, которое может быть взято у нескольких доноров, которые должны быть подобраны по антигенам АВО и HLA, что сделать очень сложно (Хью Р.К. Барбер "Иммунобиология для практических врачей"//М., "Медицина", 1980г., с. 137-138). Очистка не обеспечивает освобождение тромбоцитов от примеси эритроцитов и лейкоцитов полностью, а также от веществ, преимущественно белковой природы, определенных плазмой крови, которые обволакивают тромбоциты толстым слоем снаружи (З.С.Баркаган "Геморрагические заболевания и синдромы"//М., "Медицина", 1989 г., с. 14-15).
Целью настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, т.е. создание способа получения тромбоцитов, полностью свободных от факторов, определенных плазмой крови и других форменных элементов ее, имеющих наперед заданные характеристики, и экономия крови.

Метод

Указанная цель достигается тем, что тромбоциты, полученные из малого количества крови путем дифференциального центрифугирования, помещают в среду, содержащую определенный набор химических веществ, и выдерживают в ней при определенных физических и химических условиях, при соблюдении условий строгой стерильности, т.е. дополнительно производится культивирование тромбоцитов в питательной среде, что и определяет возможность их получения в большом количестве, при минимальной затрате крови. Полученные таким способом тромбоциты не несут на своей мембране факторы, определяемые кровью донора. Выделение тромбоцитов из среды производится фильтрованием или центрифугированием с одновременной отмывкой солевыми средами. Среда, применяемая культивирования тромбоцитов, имеет следующие компоненты в мг/л:

Хлористый кальций	3 - 200
Хлористый калий	5 - 10000
Хлористый цинк	0,01 - 100
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный	5 - 10000
Сульфат магния	0,01 - 100
Гексацианоферрат /11/ калия	0,01 - 200
DL лейцин	3 - 2000
DL серин	1,9 - 1500
DL триптофан	0 - 500
L цистеин	0 - 400
L гистидин	1,7 - 1500
L аргинин	0,6 - 500
L глютаминовая кислота	1,1 - 1000
DL метионин	0,5 - 500
L пролин	0,8 - 1000
L аспарагин	0,9 - 1000
DL лизин	0 - 700
L глютамин	0 - 500
Аминоуксусная кислота	0,3 - 500
Сахароза	100 -10000
Аденозинтрифосфат	0 - 2000
Фолиевая кислота	0,01 - 0,5
Тиамина бромид	0,01 - 1
Пангамат кальция	0,01 - 0,5
Пиридоксина гидрохлорид	0,01 - 0,5
Цианокобаламин	0,01 - 0,5
Аскорбиновая кислота	0,01 - 1
Вода дистиллированная	один литр

Сахаразу можно заменить инозитом, дульцитом или маннитом, взяв их в том же количестве.

Культивирование

Культивирование тромбоцитов возможно при условии восполнения потребляемого ими кислорода. Поэтому культивирование можно проводить в тонком слое при доступе к поверхности свежего воздуха, или применив продувание питательной среды воздухом мелкими пузырями, что дополнительно предотвращает агрегацию тромбоцитов.
Добавив в среду агар-агар, можно получить твердую питательную среду, при этом можно не вводить углеводы, т.к. тромбоциты разжижают агар-агар.
Культивирование можно производить в стеклянной посуде, но нужно учесть, что примеси в стекле влияют на интенсивность роста, поэтому желательно использовать кварцевое стекло. Форма посуды может быть любой.
Культивирование производится в термостате при температуре 0 - 44°С в течение 1- 50 суток.
Первый этап развития культуры тромбоцитов, выделенных из крови, занимает длительное время, для его сокращения нужен редкий посев и отмывание тромбоцитов, например, 0,9% раствором хлористого натрия, перед посевом. Культура после последующих пересевов развивается быстрее. Срок развития может служить индикатором чистоты культуры.
Применяя известные методы пересева с жидкой питательной среды на твердую и обратно, можно добиться желаемой однородности и очистки тромбоцитов.
Экономию крови можно считать полной, т.к. она используется только для первоначального посева.
Конечным продуктом являются тромбоциты, образовавшиеся в результате некоторого деления исходных тромбоцитов, полученных из крови, при их росте и размножении на искусственной питательной среде. Поэтому способ дает возможность получить нужное количество тромбоцитов, свободных от плазмы крови и антигенов, определяемых ею.

Пример исполнения

Способ включает приготовление питательной среды, взятие крови, выделение и отмывку тромбоцитов, поспев, культивирование, выделение из среды культивирования и промывку.
Для приготовления 100 мл питательной среды заготовляют навески следующих веществ в мг:

Хлористый кальций	5
Хлористый калий	300
Хлористый цинк	0,01
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный	50
Сульфат магния	0,01
Гексацианоферрат /11/ калия	0,01
DL лейцин	3
DL серин	1,9
DL триптофан	0,37
L цистеин	0,28
L гистидин	1,66
L аргинин	0,63
L глютаминовая кислота	1,1
DL метионин	0,52
L пролин	0,76
L аспарагин	0,86
DL лизин	0,9
L глютамин	0,26
Аминоуксусная кислота	0,22
Сахароза	200
Фолиевая кислота	0,01
Пангамат кальция	0,01

Аминокислоты и витамины растворяются, каждая в отдельности, в 2 мл воды (вода везде используется дистиллированная, фармакопейная). В чистую (вся посуда моется хозяйственным мылом, с последующей обработкой хромовой смесью) колбу, емкостью 250 мл, наливается 50 мл воды. В ней растворяют хлористый калий, хлористый кальций, хлористый цинк, натрий фосфорнокислый двухзамещенный, сульфат магния, гексацианоферрат/11/ калия и сахарозу. В полученный раствор вливают растворы аминокислот и витаминов. Объем раствора доводят водой дл 97,5мл. Колбу закрывают ватно-марлевым тампоном и раствор стерилизируют в автоклаве при давлении 0,5 атмосферы в течение 10 минут. В остывший раствор стерильно добавляют 2 мл 1%раствора аденозинтрифосфата и 0,5мл смеси следующего состава в мл:

Тиамина бромид 6% раствор	0,05
Пиридоксина гидрохлорид 5% раствор	0,05
Цианокобаламин 10% раствор	0,05
Аскорбиновая кислота 5%	0,05

разбавленных 10 мл воды.
30 мл полученной среды переливают в колбу емкостью 100 мл и к ней добавляют 750 мг выщелоченного агар-агара. На водяной бане добиваются растворения агара и полученный раствор разливают в две чашки Петри, которые стерилизуют в автоклаве при 0.5 атмосферы 10 минут. Твердую и жидкую питательные среды помещают в термостат на 72 часа при температуре 37°С, для проверки стерильности. Одновременно среды обогащаются кислородом.
Культивирование производится в следующем устройстве: пробирка с отводом закрывается резиновой пробкой с отверстием, в которое пропущена стеклянная трубка, доходящая до дна пробирки. Нижний конец трубки имеет отверстие диаметром 0,01мм. Снаружи в пробку вставляют керамический бактериальный фильтр, для стерилизации воздуха. Отвод пробирки закрыт плотной ватной пробкой и на него надета резиновая трубка, пережатая зажимом. Приготовленный прибор в двух экземплярах стерилизуется в автоклаве при 1 атм 0,5 часа. Пробирки заполняют жидкой питательной средой в количестве 10 мл каждая. Емкость пробирок с отводом 50 мл.

Получение тромбоцитов

Для получения тромбоцитов, для посева берут 0,05 мл крови донора из пальца, кожу обрабатывают бензином, формалином, спиртом и йодом, под контролем ультрафиолетового облучения в настольном боксе, в который вводится только кисть донора, одетая в перчатку. Сделав укол прокаленной иглой, набирают в шприц 0,05 мл, в котором находится 5 мл 09% раствора хлористого натрия, энергично встряхивают и переносят в центрифужную пробирку, закрытую пробкой. Раствор крови центрифугируют при ускорении 4 м/с^2 5 минут. Надосадочную жидкость переливают в чистую центрифужную пробирку и вновь центрифугируют при ускорении 24 м/с^2 10 минут. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя в пробирке 0,1 мл жидкости. Содержимое пробирки разводят 5 мл 0,9% раствора хлористого натрия в воде и вновь центрифугируют при ускорении 24 м/с^2 5 минут. Надосадочную жидкость сливают, содержимое пробирки перемешивают, для переведения тромбоцитов во взвешенное состояние. Смесь тромбоцитов переносят в пробирку с питательной средой.

Посев

Пробирка, с посеянными в питательную среду тромбоцитами, помещается в термостат в наклонном положении, под углом 30° к горизонту, при температуре 37°С. Через каждые два часа производится продувание питательной среды воздухом 2 минуты. Для этого резиновую грушу, выжав из нее воздух, соединяют с отводом пробирки, освобождают грушу и снимают зажим с трубки. Воздух проходит через питательную среду мелкими пузырями. Пробирку при этом располагают вертикально. Наличие роста проверяют, наблюдая раздавленную каплю в микроскопе при увеличении в 600 раз. Через 192 часа из пробирки производят посев на агаризованную среду, для проверки чистоты и выделения чистой культуры от одной клетки. Для этого, из пробирки петлей набирают среду, растирают ее по поверхности агаризованной среды и той же петлей делают посев во второй чашке. Чашки помещают в термостат при 37°С. через 48 часов наблюдают выросшие колонии в микроскоп при увеличении в 105 раз. Отдельные колонии тромбоцитов на гладкой поверхности агаризованной питательной среде имеют диаметр до 5 мм. Форма круглая, полупрозрачная. Поверхность блестящая, гладкая. Структура зернистая. Цвет светло-бронзовый, у молодых заметен только на просвет, напоминают каплю воды на поверхности при условии смачиваемости. Профиль выпуклый, край ровный, в месте плотного посева колонии сливаются. Консистенция студенистая в воде плохо эмульгируют. В толщу агара не развиваются. Отдельную колонию переносят во вторую пробирку. Культивирование производится при тех же условиях. За 48 часов происходит развитие тромбоцитов до плотности 2,4х10^9 в одном мл среды, при посеве 2 колоний диаметром 4 мм в 10 мл питательной среды. (Скорость развития культуры тромбоцитов при первых посевах сильно зависит от состояния здоровья донора).
Тромбоциты от среды отделяют центрифугированием при ускорении 24 м/с^2. Надосадочную жидкость заменяют 0,9% раствором хлористого натрия, размешивают и вновь центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и в осадке получают тромбоциты.

Технико-экономическая или иная эффективность

При посеве тромбоцитов в питательную среду с плотностью 10^6 клеток на один литр за 48 часов культивирования получается 2,4х10^12 клеток, при этом, для первоначального посева использовалось 0,05мл крови. В одном литре крови здорового человека содержится в среднем 0,3х10^12 тромбоцитов. Следовательно, для получения тромбоцитов один литр питательной среды заменяет 8 литров донорской крови, при условии 100% выхода тромбоцитов из последней.
Получаемые способом культивирования тромбоциты не содержат примесей, определяемых кровью донора.
Полученные таким образом тромбоциты могут быть использованы для производства лекарственных препаратов, и свойства их могут регулироваться составом среды.

Формула изобретения

Способ получения тромбоцитов, включающий выделение тромбоцитов из крови дифференциальнвым центрифугированием и отмывку их, отличающийся тем, что, с целью экономии и повышения степени очистки, выделенные тромбоциты культивируют при 0° - 44°С в течение 2х10^5 - 3х10^6с при аэрации в питательной среде, содержащей следующие компоненты, мг/л:

Хлористый кальций	3 - 200
Хлористый калий	5 - 10000
Хлористый цинк	0,01 - 100
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный	5 - 10000
Сульфат магния	0,01 - 100
Гексацианоферрат /11/ калия	0,01 - 200
DL лейцин	3 - 2000
DL серин	1,9 - 1500
DL триптофан	0 - 500
L цистеин	0 - 400
L гистидин	1,7 - 1500
L аргинин	0,6 - 500
L глютаминовая кислота	1,1 - 1000
DL метионин	0,5 - 500
L пролин	0,8 - 1000
L аспарагин	0,9 - 1000
DL лизин	0 - 700
L глютамин	0 - 500
Аминоуксусная кислота	0,3 - 500
Сахароза	100 -10000
Аденозинтрифосфат	0 - 2000
Фолиевая кислота	0,01 - 0,5
Тиамина бромид	0,01 - 1
Пангамат кальция	0,01 - 0,5
Пиридоксина гидрохлорид	0,01 - 0,5
Цианокобаламин	0,01 - 0,5
Аскорбиновая кислота	0,01 - 1
Вода дистиллированная	один литр

Дополнение: культура тромбоцитов на указанной среде с агар-агаром, совершенно высохшем, может существовать 16 лет, расселяясь.